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动物克隆技术中细胞同步化处理的意义和方法  

2016-02-01 11:52:08|  分类: 选修三 |  标签: |举报 |字号 订阅

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动物克隆技术中细胞同步化处理的意义和方法 - wangmiaomiao0916 - wangmiaomiao0916的博客

 

浙教版高中《生物学·选修现代生物科技专题》P.362-12“绵羊多莉克隆过程”中来自白色芬兰母羊的乳腺细胞在被取出细胞核前先进行了营养限制性培养,什么是营养限制性培养?进行营养限制性培养的目的何在?教材中缺乏详细介绍,不利于读者的理解。实际上,营养限制性培养的目的是为了使供体细胞的细胞周期同步化,进而提高克隆成功率。下面笔者对细胞同步化技术的定义、动物克隆技术中细胞同步化处理的意义和方法进行具体阐述,以供教学参考。

1   细胞同步化技术

   在一般培养条件下,群体中的细胞分裂并不同步,往往处于细胞周期的不同时相中。为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡,常需采取一些方法使细胞处于细胞周期的同一时相,这就是细胞同步化技术。采用不同的同步化技术,可使细胞同步于不同的时期。比如,利用TdR(胸腺嘧啶核苷,过量会抑制DNA合成[1])可逆性地抑制S期细胞DNA合成而不影响细胞周期其他时相的运转,最终可将细胞群体同步化于S期。

2   动物克隆技术中细胞同步化处理的意义

供体细胞核与受体细胞质融合后,核重编程能否顺利完成、染色体倍性是否正确是克隆胚胎能否顺利发育至分娩的关键因素。

2.1  细胞周期与核重编程的关系     处于有丝分裂各时期的细胞作为核供体,一旦移植到卵母细胞后,移植核在卵质环境里将出现重塑而再程序化[2],即核重编程。核重编程是指核移植后供体核停止本身的基因表达程序,恢复为胚胎发育所必需的胚胎化基因表达程序状态。核移植完成后,核重编程立即开始进行,其过程包括染色体结构重建、DNA甲基化、组蛋白乙酰化、印记基因表达、端粒长度恢复、X染色体失活等。经过核重编程供体核的基因重新归零,由分化状态恢复为未分化的初始基因表达状态。只有供核发生完全重编程,重构胚才能正常发育。核重编程与供核者年龄、供核细胞的组织来源、分化状态、细胞周期、传代次数及供卵者得年龄、卵子的成熟度等因素均有关。[3] 克隆羊Dolly的成功很大程度上被归功于将供核细胞诱导到G0期,WilmutCampbell认为自己成功的关键是将供体细胞诱导进入G0期,G0期细胞的染色体被认为进行了某种修饰,而这种修饰对重编程可能十分关键。[4]但后来研究发现,用G1MG2期的细胞作为供体也可以获得成功。

2.2  细胞周期与染色体倍性的关系    重构胚的染色体倍性的正确与否也是决定重构胚发育率高低的重要因素。只有移植核和受体卵质相容,才能避免重建胚的 DNA 损伤并保持胚胎的正确倍性。如不相容,发育一旦启动,被移植的供体核就会发生染色体畸变,导致克隆失败。[2] 目前,由于S期细胞处于DNA合成阶段,重构胚易形成2倍化和4倍化之间的非整倍体动物,而没有克隆个体的报道之外,其他时期的细胞都被证明可作用供体,用于克隆研究。[5]

研究表明,相比于其它各细胞周期的核供体,G0/G1期细胞作为供体细胞与MII期去核卵母细胞进行核移植后,重构胚的早期卵裂率及囊胚发育率均明显较高。因此,进行动物克隆时多将供体细胞同步化于G0/G1期。

 3   动物克隆技术中细胞同步化处理的方法

3.1  血清饥饿法   血清饥饿法是诱导供体细胞进入G0/G1期阶段的主要方法,克隆羊Dolly的培养过程中即采用了此方法。其原理是:哺乳动物细胞需要促有丝分裂因子(如血清)才能经过 G1期进入周期,当细胞经过了G1 晚期的关卡后便能够不依赖外源促有丝分裂因子的刺激而自主进入周期。[6]降低血清浓度会使G1 晚期之前的细胞缺乏促有丝分裂因子而停滞于G1期,其它细胞则在自主完成分裂后进入不分裂的状态,即 G0 期。由于流式细胞术分析不能将两者严格区分开,因此细胞便被同步化为G0/G1若再给予足够的血清刺激,细胞则能够以较为同步的状态继续进入细胞周期。由于培养过程中通过降低血清浓度限制了细胞增殖所必需的某些营养,因此教材中将这种培养方式称为营养限制性培养。具体操作方法一般为:取处于指数生长期的细胞,用含0.5%-1%小牛血清的培养基培养48-72h或无血清培养基培养24h,接着用0.1%-0.25%胰蛋白酶消化处理,离心收集细胞,然后经PI染色后用流式细胞分析仪分析细胞周期各时相的细胞百分数。实验表明,血清浓度、饥饿时间和细胞传代阶段等因素都会影响细胞同步化的效果,需根据实际需要选择合适的方案。另外值得注意的是,虽然适当延长饥饿时间可以提高G0/G1期细胞的比例,但是饥饿时间过长不仅不会使G0/G1期细胞的比例进一步提高,反而会造成大量DNA断裂,引发细胞凋亡。

3.2  接触抑制法   将生长细胞培养至完全汇合使其接触抑制,是将细胞同期化G0/G1期的另一种有效方法。接触抑制也叫密度依赖性生长抑制,是指单层培养中的正常细胞一旦相互接触并达到临界细胞密度,细胞即停止分裂的现象。将培养细胞持续培养长满,达到100%汇合形成单层后自我抑制使之停止生长便可同步化到静止期。目前接触抑制的机制尚不甚清楚,一般认为,一方面接触抑制是由于细胞数量的增加消耗了局部区域的促有丝分裂因子,另一方面是细胞接触时自身分泌了一些细胞增殖的抑制因子。但也有实验表明,有些细胞(如星形胶质细胞)间的接触抑制是由于细胞相互接触诱发了增殖抑制机制所引起的。[7] 近年来,利用汇合完全的细胞核作为供体已成功生产了转基因山羊(Melican et a1.,2005)以及克隆狗(Jang et a1.,2007)。[8]

3.3  化学处理法   细胞周期蛋白依赖性激酶(cell cyclin-dependent kinaseCDK)在细胞周期循环过程中发挥重要作用。其中细胞周期蛋白依赖性激酶2CDK2)可与细胞周期蛋白AE结合,使细胞由G1期向S期转变。RoscovitiveCDK2的抑制剂,用它处理培养细胞可将细胞同步于G0/G1检验点,提高培养细胞中G0/G1期的比例。Gibbons[9]Roscovitive对牛颗粒细胞处理后,有82.4%的细胞处于静止状态的G0/G1期,而对照组(血清饥饿组)76.7%。虽然囊胚发育率比对照组低,但囊胚细胞数和成活胎儿数都较对照组高。

   S期外,其他时期的细胞作为核供体均有成功克隆的案例。上文主要介绍了三种常见的将细胞同步化于G0/G1期的方法,若要将细胞同步于其它时期,处理方法则有所不同,具体不再赘述。

主要参考文献

[1] ,江千令,阚云超等.家蚕BmN细胞S期同步化体系建立[J].中国农学通报,2014, 30(2):40

[2] 乔岩岩,史小林.体细胞核移植的研究进展—核移植供体细胞与受体细胞的选择[J].生殖医学杂志, 2005,14(2):114-115

[3] , ,孙贻娟.体细胞核移植后核重编程的影响因素[J].生命科学,2006,18(4):355-357

[4] .TSA处理对供体细胞骨架、周期和组蛋白乙酰化的影响[D].硕士论文.西北农林科技大学,2008:4

[5] 李亮亮, , 军等.影响动物克隆效率因素的研究进展[J].中国草食动物,2006, 30(4):65

[6] 严丽萍,陶茂萱.血清饥饿和接触抑制两种G0期同步化方法效果评价[J].卫生研究,2007, 36(3):277

[7] 马俊芳. CD81在星形胶质细胞接触抑制中的作用机制初探[D].硕士论文.华中科技大学.2007:1

[8] 吴正三,杨素芳,陈凌声.猪成纤维细胞细胞周期同期化对核移植胚胎发育的影响[J].基因组学与应用生物学,2013,32(1):2-4

[9] Gibbons J, Arat S, Rzucidlo J, et al. Enhanced survivability of cloned calves derived from roscovitine-treated adult somatic cell[J]. Biol Reprod, 2002,66(4):895-900

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